Cette page correspond à l’analyse des résultats du SNP calling effectué avec mon petit programme phruscle (“phred + muscle”).
Pour rappel, ce programme utilisait phred sur les fichiers de séquençage pour déterminer les bases. Les séquences obtenues étaient ensuite alignées à un alignement de référence composé de la séquence sauvage et de la séquence du gène synthétique.
J’ai ensuite analysé les sorties de phred qui recense la qualité des bases appelées. J’ai pu ainsi attribuer un score de qualité à toutes les bases non chimériques, ie avec une correspondance dans l’alignement de référence et dans le fichier de séquençage.
library(dplyr)
library(ggplot2)
library(readr)
library(viridis)
library(cowplot)
library(extrafont)
#
fte_theme <- function() {
## inspiré de http://minimaxir.com/2015/02/ggplot-tutorial/
## Generate the colors for the chart procedurally with RColorBrewer
palette <- RColorBrewer::brewer.pal("Greys", n=9)
color.background = palette[2]
color.grid.major = palette[3]
color.axis.text = palette[6]
color.axis.title = palette[7]
color.title = palette[9]
## Begin construction of chart
theme_bw(base_size=9) +
## Set the entire chart region to a light gray color
theme(
text = element_text(family = "Ubuntu Light"),
panel.background=element_rect(
fill=alpha(color.background, 1), color=color.background),
plot.background=element_rect(
fill=alpha(color.background, 0.5), color=color.background),
panel.border=element_rect(color=color.background),
panel.grid.major=element_line(
color=color.grid.major,size=.25, linetype = "dotted"),
panel.grid.minor=element_blank(),
axis.ticks=element_blank(),
strip.text.y = element_text(angle = 0, size = 8),
legend.position="none", # Format the legend, but hide by default
legend.background = element_blank(),
legend.text = element_text(size=9,color=color.axis.title),
legend.key = element_rect(
fill = scales::alpha("gray", 0),
colour = scales::alpha("gray", 0)),
## Set title and axis labels, and format these and tick marks
plot.title = element_text(
color = color.title, size = 14, face = "bold", vjust = 1.25,
hjust = 0, family = "Ubuntu"),
axis.text.x = element_text(size = 7,color = color.axis.text),
axis.text.y = element_text(size = 7,color = color.axis.text),
axis.title.x = element_text(
size = 8, color = color.axis.title, vjust = 0, hjust = 0.9),
axis.title.y = element_text(
size = 8, color = color.axis.title, vjust = 0.9, angle = 0 ),
## Plot margins
plot.margin = unit(c(0.35, 0.2, 0.3, 0.35), "cm")
)
}
#
theme_set(theme_bw() + fte_theme())
#
legend_position <- function(x=NULL, y=NULL) {
custom_legend <- theme(
legend.margin = unit(-0.3,"lines"),
legend.key = element_rect(fill = scales::alpha("gray", 0),
colour = scales::alpha("gray", 0)))
if (is.null(x) & is.null(y)) {
custom_legend + theme(legend.position = "bottom")
} else {
custom_legend + theme(legend.position = c(x, y))
}
}
#
data_location <- "../../data/phruscle_snpcall.csv"
#
snp <- read_csv(data_location, col_types = "ccciciccid", trim_ws = TRUE) %>%
mutate(
name = gsub("-1073.+$", "", name),
base = toupper(base)#,
)
#
find_mutant <- function(name) {
if (grepl("ws", name)) "ws"
else if (grepl("sw", name)) "sw"
else if (grepl("W", name )) "w"
else if (grepl("S", name )) "s"
else ""
}
#
# neat little trick to reduce time of rowwise application of find_mutant.
snp <- snp %>%
group_by(name) %>%
summarise(count = n()) %>%
rowwise() %>%
mutate(mutant=find_mutant(name)) %>%
inner_join(snp, .) %>%
filter(mutant != "")J’ai donc obtenu un tableau de donnée de la forme suivante, où :
cons: un code maison pour déterminer le consensus. . si les trois bases sont identiques, x si la base séquencée est la base introduite, X si la base séquencée est la base sauvage, N si c’est encore autre chose.name: le nom expérimental de la séquencerefb: la base de référencerefp: la position sur la référence.seqb: le reverse complement de la base séquencée.seqp: la position sur la séquence expérimentale.snpb: la base sur le gène synthétique introduit.base: la base séquenceé.qual: sa qualité.phase: la position sur le spectrogramme.mutant: ordinal, la manip.Vincent appelle ça joliment un alignement pairwise en colonne.
head(snp)## Source: local data frame [6 x 12]
##
## cons name refb refp seqb seqp snpb base qual phase count mutant
## (chr) (chr) (chr) (int) (chr) (int) (chr) (chr) (int) (dbl) (int) (chr)
## 1 . pS1 T 125 T 1 T T 12 236 694 s
## 2 . pS1 T 126 T 2 T T 29 252 694 s
## 3 . pS1 G 127 G 3 G G 32 268 694 s
## 4 . pS1 T 128 T 4 T T 29 280 694 s
## 5 . pS1 C 129 C 5 C C 32 292 694 s
## 6 . pS1 T 130 T 6 T T 29 305 694 s
n_distinct(snp$name)## [1] 382
On a donc bien toutes nos séquences.
snp %>%
group_by(mutant) %>%
summarise(count = n()) %>%
knitr::kable(align = "c")| mutant | count |
|---|---|
| s | 64904 |
| sw | 72509 |
| w | 69927 |
| ws | 74074 |
snp %>%
group_by(mutant, name) %>%
summarise(count = n()) %>%
ggplot(data = ., aes(x = count )) +
geom_histogram(binwidth = 1) +
labs(x = "Nombre de positions", y = "",
title = "Distribution du nombre\nde positions par séquence")J’ai voulu déterminer s’il existe des bases dans les sorties de phruscle qui ne correspondent pas aux sorties de phd. Autrement dit si la base base est bien toujours la même que la base seqb.
FALSE %in% (snp$base == snp$seqb)## [1] FALSE
Plutôt bon signe ! Phruscle a fonctionné comme il faut, ie toutes les bases qu’on a sorties dans nos alignements ont une correspondance dans le fichier phred !.
J’ai regardé globalement la distribution de la qualité des bases :
snp %>%
ggplot(data = ., aes(x = qual )) +
geom_histogram(binwidth = 1)J’ai regardé séquence par séquence les variation de qualité le long de la séquence :
snp %>%
ggplot(data = ., aes(x = refp, y = qual, color = qual )) +
geom_point(alpha = 0.1, size = 0.1) +
geom_line(aes(group = name), alpha = 1/20, size = 0.1 ) +
scale_color_viridis()
Position des bases de qualité < 30
snp %>%
filter(qual < 30) %>%
ggplot(data = ., aes(x = refp, y = qual )) +
geom_point(alpha = 0.1, size = 0.1)Certaines séquences ne sont pas des plus propres. On peut certainement les virer pour ne garder que les bonnes séquences. Comme pour le cas de la séquence psw21.
J’ai choisi pour statistique la qualité médiane, la qualité moyenne étant trop influencée par les baisses de qualité dans les positions terminales. De plus, la médiane a une distribution plus centrée que la moyenne.
snp %>%
group_by(name) %>%
summarise(median = median(qual)) %>%
qplot(data = . , median, binwidth = 0.1) +
geom_vline(xintercept = 40, color = "red")
snp %>%
group_by(name) %>%
summarise(mean = mean(qual)) %>%
qplot(data = . , mean, binwidth = 0.1) +
geom_vline(xintercept = 40, color = "red")La fonction suivante permet donc de ne garder que les séquences dont la qualité médiane est supérieure à 40.
keep_clean_only <- function(data, qual_ = 40) {
get_dirty_seq <- function(data)
group_by(data, name) %>%
summarise(median = median(qual)) %>%
filter(median < qual_) %>%
select(name) %>% unlist()
data %>%
filter(!(name %in% get_dirty_seq(data)))
}Comme attendu, la qualité est moindre en fin de run, et plutôt bonne au début1 On séquence de gauche à droite, la cassette de résistance est en 3’. Ce sont des séquences trimmées par phd. On n’est pas obligé de trimmer, mais ça permet de ne garder que les séquences qui vallent le coup. Peut-être refaire les analyses avec les séquences non trimmées. # Distribution de la longueur des séquences. Comme attendu, la longueur des séquences est plus élevée avec les constructions SW et WS, puisqu’on a placé l’amorce légérèment en amont de la construction.
snp %>%
group_by(name, mutant) %>%
summarise(len = max(refp) - min(refp)) %>%
ggplot(data = ., aes(x = len )) +
geom_histogram(binwidth = 1) +
facet_grid(mutant ~ .)
snp %>%
filter(cons == "x" | cons == "X") %>%
## filter(refp < 750 & refp > 40) %>%
ggplot(aes(x = refp)) +
geom_histogram(binwidth = 1)find_polarity <- function(reference, experimental) {
is_w <- function(base) { ifelse(base == "A" | base == "T", TRUE, FALSE)}
is_s <- function(base) { ifelse(base == "C" | base == "G", TRUE, FALSE)}
if (is_w(reference) & is_w(experimental)) "ww"
else if (is_w(reference) & is_s(experimental)) "ws"
else if (is_s(reference) & is_w(experimental)) "sw"
else if (is_s(reference) & is_s(experimental)) "ss"
else ""
}La fonction suivante permet de créer les alignement via ggplot2. Les clones sont triés par longueur de trace de conversion par la fonction embarquée sort_by_tract_length.
plot_align <- function(data, mutant_) {
sort_by_tract_length <- function(mut) {
data %>%
filter(mutant %in% mut) %>%
group_by(name, mutant) %>%
filter(cons == "x") %>% # dernière position correspondant au donneur
summarise(len = min(refp)) %>%
ungroup() %>%
arrange(len) %>%
{.$name}
}
is_inside_conv <- function(data, mut) {
data %>%
filter(mutant %in% mut, cons == "x") %>%
group_by(name) %>%
summarise(bascul = min(refp)) %>%
inner_join(data, ., by = "name") %>%
keep_clean_only() %>%
## garde les positions après le point de switch qui correspondent au génotype parental.
filter(refp > bascul, cons == "X" | cons == "x") %>%
mutate(tract = TRUE) %>%
select(name, bascul, refp, tract) %>%
left_join(data, .)
}
is_restoration <- function(data, mut) {
## détermine si le SNP est une restauration du génotype parental. Autrement
## dit les SNP qui sont dans la trace de conversion mais qui sont X, *ie*
## des SNPs parentaux.
data %>%
filter(mutant %in% mut, cons == "X", tract == TRUE)
}
## default color
red <- RColorBrewer::brewer.pal(n = 4, "Set1")[1]
blue <- RColorBrewer::brewer.pal(n = 4, "Set1")[2]
green <- RColorBrewer::brewer.pal(n = 4, "Set1")[3]
violet <- RColorBrewer::brewer.pal(n = 4, "Set1")[4]
data <-
is_inside_conv(data, mutant_) %>%
group_by(name, mutant) %>%
filter(mutant %in% mutant_, cons == "x" | cons == "X" ) %>%
rowwise() %>%
mutate(sens = find_polarity(refb, seqb)) %>%
ungroup() %>%
keep_clean_only()
data$tract[is.na(data$tract)] <- FALSE
ggplot(data = data,
aes(x = factor(refp),
y = factor(name, levels = sort_by_tract_length(mut=mutant_)))) +
geom_point(aes(color = tract, size = qual, alpha=qual)) +
## représente les cas complexes
geom_point(data = is_restoration(data, mutant_),
aes(alpha = qual), color = green, size = 5) +
## représente la séquence du donneur
geom_text(aes(label = snpb, x = factor(refp), y = -3), color = blue,
vjust = -0.5, size = 2, family = "Ubuntu Light") +
annotate("text", x = 1.2, y = -0.8, label = "Donneur : ", color = blue, size = 2 ) +
## représente la séquence du receveur.
geom_text(aes(label = refb, x = factor(refp),
y = length(sort_by_tract_length(mutant_)) + 10),
color = red, vjust = 9, size = 2, family = "Ubuntu Light") +
annotate("text", x = 1.2, y = length(sort_by_tract_length(mutant_)) + 5,
label = "Receveur : ", color = red, size = 2 ) +
scale_color_brewer(palette = "Set1", guide = "none") +
scale_alpha( range=c(1/5, 0.8), guide=FALSE ) +
scale_size(range = c(0.5, 2), breaks = c(10, 50),
labels = c("Faible", "Forte")) +
labs(x = "", y = "", size = "Qualité",
title = paste("Alignement pour la manip", toupper(mutant_))) +
theme(legend.direction = "horizontal",
## legend.position = c(0.8, -0.2),
legend.margin = unit(0,"lines"),
## legend.key = element_rect(fill = scales::alpha("gray", 0),
## colour = scales::alpha("gray", 0)),
panel.grid.major.y = element_line(size = 0.1, linetype = "dotted")) +
legend_position(0.8, 0.98)
}
plot_qual <- function(data, mutant_) {
red <- RColorBrewer::brewer.pal(n = 4, "Set1")[1]
blue <- RColorBrewer::brewer.pal(n = 4, "Set1")[2]
data %>%
filter(mutant == mutant_) %>%
ggplot(aes(x = refp, y = qual)) +
geom_point(aes(color = qual), size = 1/10, alpha = 1/20) +
geom_smooth(se = FALSE, color = red, linetype = "dotted") +
scale_color_continuous(high = blue, low = red) +
labs(x = "Position sur la référence", y = "")
}
plot_align_qual <- function(data, mutant_) {
plot_grid(
data %>% plot_align(mutant_),
data %>% plot_qual(mutant_),
ncol = 1, rel_heights = c(8.5, 1.5),
align = 'v', labels = c(" 1", " 2")
)
}snp %>% plot_align_qual("ws")
snp %>% plot_align_qual("sw")
snp %>% plot_align_qual("s")
snp %>% plot_align_qual("w")
plot_grid(
snp %>% plot_align_qual("s"),
snp %>% plot_align_qual("w"),
snp %>% plot_align_qual("ws"),
snp %>% plot_align_qual("sw"),
labels = c("A", "B", "C", "D"), ncol = 2
)